Welche Berechnungen sind vor der Durchführung einer PCR notwendig und wie werden diese durchgeführt?

Vor der Durchführung einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) gibt es mehrere wichtige Berechnungen, die du berücksichtigen musst:

1. **Konzentration der DNA-Vorlage**:
- Bestimme die Konzentration der DNA-Vorlage, die du in der PCR verwenden möchtest. Dies kann durch Messung der Absorption bei 260 nm (A260) mit einem Spektralphotometer erfolgen.
- Berechne die benötigte Menge an DNA in ng oder µg, basierend auf der gewünschten Endkonzentration in der PCR-Reaktion.

2. **Primer-Konzentration**:
- Berechne die Menge an Primern, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 0,1-1 µM) zu erreichen.
- Beispiel: Wenn du eine 10 µM Primer-Lösung hast und eine Endkonzentration von 0,5 µM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 2,5 µL der Primer-Lösung.

3. **dNTP-Konzentration**:
- Berechne die Menge an dNTPs, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 200 µM jedes dNTPs) zu erreichen.
- Beispiel: Wenn du eine 10 mM dNTP-Mischung hast und eine Endkonzentration von 200 µM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 1 µL der dNTP-Mischung.

4. **Puffer-Konzentration**:
- Berechne die Menge des PCR-Puffers, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 1x) zu erreichen.
- Beispiel: Wenn du einen 10x PCR-Puffer hast und eine Endkonzentration von 1x in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 5 µL des 10x Puffers.

5. **MgCl2-Konzentration**:
- Berechne die Menge an MgCl2, die du hinzufügen musst, um die gewünschte Endkonzentration (typischerweise 1,5-2,5 mM) zu erreichen, falls der Puffer dies nicht bereits enthält.
- Beispiel: Wenn du eine 50 mM MgCl2-Lösung hast und eine Endkonzentration von 2 mM in einem 50 µL PCR-Ansatz benötigst, dann benötigst du 2 µL der MgCl2-Lösung.

6. **Taq-Polymerase**:
- Berechne die Menge der Taq-Polymerase, die du hinzufügen musst, basierend auf der empfohlenen Menge pro Reaktion (typischerweise 0,5-1,25 Einheiten pro 50 µL Reaktion).

7. **Gesamtvolumen**:
- Stelle sicher, dass das Gesamtvolumen der PCR-Reaktion (typischerweise 50 µL) korrekt ist, indem du die Volumina aller Komponenten addierst und mit Wasser auffüllst.

Ein Beispiel für eine typische 50 µL PCR-Reaktion könnte so aussehen:
- DNA-Vorlage: 1 µL
- Forward Primer (10 µM): 2,5 µL
- Reverse Primer (10 µM): 2,5 µL
- dNTP-Mischung (10 mM): 1 µL
- 10x PCR-Puffer: 5 µL
- MgCl2 (50 mM): 2 µL
- Taq-Polymerase: 0,5 µL
- Wasser: 35,5 µL

Diese Berechnungen helfen dir sicherzustellen, dass alle Komponenten in den richtigen Konzentrationen vorliegen, um eine erfolgreiche PCR durchzuführen.